火焰衛(wèi)矛組織培養(yǎng)再生體系優(yōu)化
發(fā)布者：華石紅楓 發(fā)布日期：2014-06-22 點擊次數(shù)：1981762
火焰衛(wèi)矛(Euonymus alatus 'compacta')屬于衛(wèi)矛科落葉灌木,因其葉片里火焰紅色而具有重要的園藝觀賞和經(jīng)濟價值,每株成熟的火焰衛(wèi)矛每年能生產(chǎn)成百上千粒種子。由于通過鳥類和流水的傳播,火焰衛(wèi)矛在美國非常流行,甚至不可控制,破壞其他植物區(qū)系,嚴重威脅生態(tài)平衡。本研究以火焰衛(wèi)矛為研究對象,優(yōu)化了植株組織培養(yǎng)再生體系,并在此基礎上探索農(nóng)桿菌介導火焰衛(wèi)矛遺傳轉(zhuǎn)化技術,為利用基因工程技術對火焰衛(wèi)矛進行遺傳改良打下了基礎。主要研究結果如下: (1)火焰衛(wèi)矛植株組培再生體系優(yōu)化 本研究以火焰衛(wèi)矛成熟胚培養(yǎng)長出的子葉、下胚軸為外植體進行組織培養(yǎng)及植株再生研究,優(yōu)化了火焰衛(wèi)矛組織培養(yǎng)再生體系。研究結果表明:成熟胚培養(yǎng)基為WPM+TDZ0.5mg·L~(-1);愈傷組織誘導培養(yǎng)基為WPM+6-BA6 mg·L~(-1)+IBA0.2 mg·L~(-1);不定芽分化培養(yǎng)基為WPM+6-BA6 mg·L~(-1)+IBA0.2 mg·L~(-1);不定芽增殖和壯苗培養(yǎng)基為WPM+6-BA4 mg·L~(-1);生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.2 mg·L~(-1)+AC0.5 g·L~(-1)。移栽基質(zhì)為營養(yǎng)土,成活率為83.3%。 (2)農(nóng)桿菌介導火焰衛(wèi)矛遺傳轉(zhuǎn)化體系建立 以火焰衛(wèi)矛子葉和下胚軸為轉(zhuǎn)化受體進行遺傳轉(zhuǎn)化體系研究,確定了子葉和下胚軸不定芽分化的有效卡那霉素(kan)篩選壓分別為60 mg·L~(-1)和50 mg·L~(-1);而在抑菌劑頭孢霉素(cef)和特美汀(Timentin)濃度對比研究中發(fā)現(xiàn),Timentin對不定芽分化的影響要小于頭孢霉素(Cef)的影響,Timentin濃度為400 mg·L~(-1)時,子葉分化率達到23.89%,而Cef在相同濃度下子葉分化率僅為15.56%;并確定Timentin最佳抑菌濃度為200 mg·L~(-1)。探討了遺傳轉(zhuǎn)化過程中外植體預培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)時間、浸染菌液濃度和浸染時間對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。結果表明,外植體預培養(yǎng)2 d,共培養(yǎng)3d,菌液濃度OD600為0.4～0.5,浸染6 min為最佳技術參數(shù);在YEP液體培養(yǎng)基中添加100μmol·L~(-1)AS可提高轉(zhuǎn)化率8.8%。 (3)轉(zhuǎn)基因植株篩選鑒定 通過農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化火焰衛(wèi)矛,并對轉(zhuǎn)化植株進行GUS組織活性及PCR檢測,證明由Barnase和iaaM組成的超級不育表達元件已經(jīng)整合到火焰衛(wèi)矛植株,從78株抗性植株中篩選出轉(zhuǎn)基因植株3株。
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